熒光光譜技術是一種通過測量物質吸收光后發(fā)射的熒光光譜來研究物質性質的技術。本文根據(jù)《JY-T 0571-2020》，簡單總結了熒光光譜分析測試或分析方法原理。

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1熒光定性定量分析原理

熒光分析主要是指利用某些物質在特定波長光的激發(fā)下，產(chǎn)生特定波長和特定強度熒光等的特性進行物質的定性和定量的分析方法。

注：定量分析僅限于稀溶液樣品，一般不直接用于固體樣品定量分析。

1.1定性分析

常采用直接比較法，將樣品的激發(fā)和發(fā)射光譜峰的數(shù)目、位置、強度以及光譜形狀（極值和拐點）、發(fā)射光譜壽命等特征，與標準物的譜圖作比較，以確定物質種類。

1.2定量分析

定量分析原理參見GB/T 19267.3和《中華人民共和國藥典》（2015年版）（四部）0405熒光分光光度法，包括標準對照法和標準曲線法。

注：在實際應用中，應考慮內(nèi)濾效應對熒光強度的影響。

2熒光量子產(chǎn)率分析原理

熒光量子產(chǎn)率的測定有參比法和絕對法兩種。

2.1參比法

也稱相對法，是用已知量子產(chǎn)率的熒光標準物質作為參比對待測熒光試樣進行量子產(chǎn)率的測試。在相同激發(fā)條件下，分別測定待測熒光試樣和參比熒光標準物質兩種稀溶液的積分熒光強度（即校正熒光光譜所包括的面積），以及對該激發(fā)波長人射光的吸光度，再將這些值分別代入公式（1）進行計算：

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2.2絕對法

采用積分球對熒光量子產(chǎn)率進行測量，適用于液體、固體、薄膜和粉末樣品，目前一般測試波長范圍為300 nm~800nm。待測樣品各個方向的發(fā)射光經(jīng)過積分球均勻化后從出射口出來，并經(jīng)過單色器最后被檢測器所檢測。測定時，分別測定待測熒光試樣和空白試樣的熒光峰面積和激發(fā)峰面積（均為校正后）再將這些值分別代入公式（2）進行計算：

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3熒光偏振分析原理

熒光偏振（P）和熒光各向異性（r）定義為公式（3）和公式（4）。

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4熒光壽命分析原理

熒光壽命的測試一般采用時間相關單光子計數(shù)法（time correlated single photon counting），簡稱“TCSPC法”；或相調制技術，也稱為“頻域法（frequency-domain method）”；或頻閃分時法，簡稱"STROBE”法。TCSPC、頻域法和STROBE的具體原理參見附錄A。在當今實際應用中，TCSPC法和STROBE 方法互為補充。

5時間分辨熒光光譜分析原理

獲得時間分辨激發(fā)/發(fā)射光譜（time-resolved excitation/emission spectra，TRES）的常用技術有；采用多波長掃描獲得一系列的衰減曲線，而后對應特定時間寬度做時間切片后，獲得時間分辨激發(fā)/發(fā)射光譜；對應的測試技術有boxcar（取樣積分技術）、TCSPC等；直接測量方法，采用可以采集光譜的多道檢測器，比如 ICCD（intensified charge-coupled device）、條紋相機、微通道板（multiple channel tube，MCP）等，經(jīng)過光譜儀色散后，直接獲得一系列設定時間寬度的瞬時光譜。

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